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重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-06-08     
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按操作手册进行,具体步骤如下。


一、重组蛋白质的诱导表达


1.挑取转化有质粒的单菌落,接种于 3ml 选择性 LB 液体培养基中,37 oC,250rpm/min 振摇培养过夜。


2. 次日将培养过夜的菌液 500 μl 再接种于 10 ml(1:::20)选择性 LB 液体培养基中,37 oC,250 rpm/min 振摇培养至光密度(OD600=0.6)时,取 1 ml 样本作为诱导前标本,10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀,-20 oC 冻存备用。


3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中,使 IPTG 终浓度为 1 mM,37 oC,250 rpm/min振摇培养 4~5 小时。取 1 ml 样本作为诱导后标本,同上法收集菌体沉淀,-20 oC 冻存备用。


4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重悬,加入等体积的 2×SDS上样缓冲液,煮沸加热 5 min,SDS 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离 ,考马斯亮蓝染色 3 小时后,脱色观察结果。


5. 选取诱导成功的细菌克隆,扩大诱导规模,收集菌体沉淀,于-20 oC 保 存 ,准备做下一步分析及纯化。


二、重组蛋白质的分离纯化


重组蛋白质的可溶性鉴定

1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中,然后在-80 oC 低温冰箱中放置 10 min。


2. 冰中解冻。


3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次,每次 10 sec,间歇 10 sec,电压 200-300 V。


4. 10000g,4oC,离心 20 min,取上清(为溶液 A), -20 oC 保存;另将沉淀用同样裂解液 1 溶解(为溶液 B),同样-20 oC 保存,供后继分析使用。


5. 将上述 A、B 溶液和诱导前后的细菌进行 SDS-PAGE 电泳,考马斯亮蓝染色,比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于 A 溶液中,则为可溶性蛋白;如果是在 B 溶液中,则为非可溶蛋白。


重组蛋白质为非可溶性蛋白(变性条件下)的分离纯化

1.将菌体沉淀溶于适量裂解液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中,室温下搅拌和吹打沉淀,避免泡沫生成。


2. 10000g,4 oC,离心 30 min,收集上清液。


3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子,并连接于 Pharmarcia 低压液相层析系统,用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose,调节 A280 值至零线。


4.将适量上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中,并用 lysis buffer 冲洗至 A280值低于 0.01。


5. 分别用 5~10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2(Wash buffer 1 and 2)清洗柱子,直至 A280 值低于 0.01。


6. 用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组蛋白质,在 A280 值监测下,收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。


三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析,最终用 0.01×PBS 透析,透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准,采用 BIO-RAD 企业蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。




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